支原体基因组DNA提取试剂盒（离心柱法）说明书
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产品详情
货号 | 规格 | 价格 |
78EA10019-50T | 50T | ￥1200.00 |
产品描述
《支原体基因组 DNA 提取试剂盒》（离心柱法）（Mycoplasma Genomic DNA Extraction Kit with Columns）的操作方法和试剂配方已经针对支原体的特点做了优化，专门用于从体外培养的细胞、细胞上 清、血清、血浆、全血、生物制品等样品中提取支原体基因组 DNA。提取的支原体基因组 DNA 可用于《一 步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR 法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》。
支原体基因组 DNA 的提取有两个作用：
（1）可以去除所有可能抑制 PCR 扩增的成分或者干扰《一步法 恒温支原体检测试剂盒》显色的成分，保证后续 PCR 扩增的正常进行或者《一步法恒温支原体检测试剂盒》 的显色不被干扰；
（2）具有浓缩支原体 DNA 的作用，可以提高相对检测灵敏度 10-100 倍。
产品组分
蛋白酶 K 溶液：Proteinase K（20 mg/mL） 1 mL
溶液 GR：Buffer GR 15 mL
溶液 GL：Buffer GL 15 mL
清洗液 GW1：Buffer GW1(Concentrate) 13 mL
清洗液 GW2：Buffer GW2(Concentrate) 15 mL
洗脱液 EB：Elution Buffer EB 15 mL
吸附柱：Spin Columns DM 50 个
收集管：Collection Tube 50 个
使用方法
使用方法
1.实验前准备及重要注意事项
1) Buffer GW1 和 Buffer GW2 的配制：第一次使用前，应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer GW1 和 Buffer GW2 中加入无水乙醇，并在试剂瓶标签中做好标记。
2) 使用前请检查 Buffer GL 是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将 Buffer GL 于 56?C 水 浴孵育重新溶解。
2. 样品处理：本试剂盒优选体外培养的细胞上清（贴壁细胞直接取细胞培养上清、悬浮培养细胞取低速 离心后的离心上清）、血清、血浆、溶液型生物制品作为提取支原体基因组 DNA 的样品。如果是粉末 型样品，需用水溶解后，再进行后续操作。
注 1：体外培养的贴壁细胞培养上清或悬浮细胞，经 1200 rpm（约 150 g）低速离心 5 分钟后（切 记：此步骤离心力不能太大，否则支原体会被离心去除了?。?，取离心后上清进行检测。
注 2：如果初始样品是加了抗凝剂的全血，经 1200 rpm（约 150 g）低速离心 10 分钟后（切记： 此步骤离心力不能太大，否则支原体会被离心去除了?。?，取上层血浆进行检测。
注 3：如果初始样品是未加抗凝剂的全血，待血液凝固后，取血清进行检测。
3. 取上述细胞上清、血清、血浆、生物制品等样品 200 μL，用移液枪吹吸均匀后，进行后续操作。
注 1：当样品量小于 200 μL 时，加入 Buffer GR 补足至 200 μl，再进行下一步实验。
注 2：如果预期待测样品支原体含量较少（比如长期低温保存的血清、血浆、胰酶、生物制品等）， 可以取上述样品 1 mL，加入 1.5 mL 离心管内，13000 rpm（约 16000 g）高速离心 5 分钟。吸走 离心后的上清 800 μL，剩余 200 μL 用移液枪吹吸均匀后，进行后续操作。此步骤起浓缩支原体的 作用，从而提高支原体检测的相对灵敏度。如果需要，上述样品的体积可以进一步放大，经过多 次高速离心后，剩余 200 μL 用于后续操作（比如，如果初始体积是 5 mL，经 5 次高速离心，取剩 余的 200 μL 进行后续操作，最终用 50 μL 洗脱液进行洗脱，则支原体 DNA 大约浓缩了 100 倍，支 原体检测的相对灵敏度也大约提高了 100 倍。）
4. 向以上溶液中加入 20 μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，混匀。
5. 加入 200 μL Buffer GL（如果室温较低，使用前请检查 Buffer GL 是否出现结晶或者沉淀，如有结晶 或者沉淀，请将 Buffer GL 于 56?C 水浴孵育重新溶解），用吸头充分吹吸均匀或用 Vortex 充分震荡。
注意：不要将 Proteinase K 和 Buffer GL 进行预混，否则 Proteinase K 可能失活。
6. 将离心管放置 56?C 水浴，孵育 15 分钟。
注意：此步骤不能省略！
7. 加入 2 μL 支原体 qPCR 内参质粒 mycoIC2（注意：内参质粒 mycoIC2 请吹吸均匀后，再加入。内参质粒 mycoIC2 只在本公司《探针法支原体检测试剂盒》内含有，如果使用其他支原体检测方法，本步骤可以 跳过?。?。
注 1：此步骤只有使用本公司《探针法支原体检测试剂盒》时，需要加入支原体 qPCR 内参质粒 mycoIC2。
注 2：加入的内参质粒 mycoIC2 用于监控支原体 DNA 的提取和后续支原体 qPCR 的扩增是否有效。
8. 加入 200 μL 无水乙醇，上下颠倒混匀数次。 l 注意：此处不能高速离心！如果需要（一般不需要离心），只能 1000 rpm（约 100 g）低速短暂 离心（20 Sec），使管壁和壁盖上的液体集中到管底。
9. 用 1 mL 吸头将所得溶液全部（含管壁和盖子上溶液）加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM） 中。12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW1（使用前检查是否加入无水乙醇!）,盖上盖子，将吸附柱快速颠倒 一次（目的：清洗管壁和盖子中的杂质），12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。
11.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW2（使用前检查是否加入无水乙醇!），盖上盖子，将吸附柱快速颠 倒一次（目的：清洗管壁和盖子中的杂质），12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱重新放回收集管中。
12.再次清洗：向吸附柱中加入 600 μL Buffer GW2（使用前检查是否加入无水乙醇!），盖上盖子，将吸附柱快速颠倒一次（目的：清洗管壁和盖子中的杂质），12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
13.继续 12,000 rpm 离心 2 分钟。离心后，在亮光下，仔细检查吸附柱内部吸附膜上方的塑料垫圈四周是 否有液体残留。如果发现吸附柱内部塑料垫圈四周有液体残留，可以将吸附柱放回收集管内，将有液 体残留的一侧放在离心力内侧，继续 12,000 rpm 离心 1 分钟。
14.离心后，经仔细检查，如果确认吸附柱内部塑料垫圈四周没有液体残留，则可以丢弃收集管，将吸附柱 置于一个新的 1.5 mL 离心管（自备）中，打开吸附柱盖子，置于 50-65℃的烘箱内放置至少 15 分钟， 以让吸附膜中的乙醇挥发干净（请务必放在 50-65℃的烘箱内放置！如果室温放置，不仅时间需要 延长，还不排除有些样品由于乙醇挥发不干净，影响后续 PCR 扩增效率，甚至失败）。
注意：打开吸附柱盖子，将吸附柱放在 50-65℃的烘箱内至少 15 分钟，此步骤非常关键！如果没 有烘箱，强烈建议购买一个。这一步的目的是将吸附膜中残余的乙醇去除，乙醇的残留会严 重影响后续的酶促反应（如：酶切、PCR 扩增等），甚至可能导致后续的 PCR 失败。
15.向吸附柱的中间部位悬空加入 50 μL Elution Buffer EB，室温放置 3 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟， 收集 DNA 溶液，-20℃保存。
运输及保存方法
该产品常温运输，室温保存（收货后，其中的 Proteinase K 放-20?C 保存）。该条件下，至少 3 年内有 效。Proteinase K 溶液可以在室温保存 2-3 个月，长期保存需要放-20?C。
