KOD-Plus-Neo是基于一种ji端嗜热的海洋古生菌Thermococcus kodakarensis的DNA聚合酶。这种聚合酶由于其高效的3’-5’核酸外切酶活性（校对活性）。该产品含有一种du特的“延伸增强剂"，可抑制传统PCR产生的“平台效应"。因此，与先前版本的KOD-Plus（KOD-201）相比，该试剂表现出更高的扩增效率和延伸能力。此外，这种酶对于PCR延伸步骤仅需要30秒/kb。这有利于长片段PCR。这种酶含有两种抑制聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗体和，从而支持热启动PCR。
产品特点
? 比普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度。
? 与传统PCR相比，“延伸增强剂"能够实现更高的扩增效率和延伸能力。
? PCR延伸步骤只需要30秒/kb。
? 两步循环条件可用于使用≥20 mer引物的扩增（退火温度，Tm>63°C）。
产品组分
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)* | 200 μL×1 |
10 x PCR Buffer for KOD -Plus-Neo | 1 mL×1 |
25 mM MgSO4 | 1 mL×1 |
2 mM dNTPs | 1 mL×1 |
引物设计
? 引物应为22-35个碱基，Tm>63℃
? 引物的最佳GC含量为45-60%。5’端和3’端的理想GC含量分别为60-70%和40-50%。
? 长片段扩增的引物应为25-35个碱基，Tm>65°C。
? 不能使用含有肌苷的引物
? 建议使用最近邻法计算引物的Tm。本手册中的Tm值是使用以下参数使用该方法计算的。Na+浓度：50 mM 寡核苷酸浓度：0.5 µM
PCR产物的克隆
? KOD-Plus-Neo由于其3’-5’核酸外切酶活性。因此，PCR产物为平端产物，可以根据平端克隆方法进行克隆。
? KOD-Plus-Neo的PCR产物应在限制性内切酶处理之前进行纯化。KOD DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在PCR反应结束时仍然存在。
? 克隆KOD DNA聚合酶产生的平端PCR产物推荐专用TA克隆试剂盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)"
实验步骤
1. 标准反应体系配置
反应物准备前，除酶溶液外，所有成分均应wan全解冻。
组分 | 体积 | 终浓度 |
10x Buffer for KOD -Plus- Neo | 5 μL | 1x |
2 mM dNTPs | 5 μL | 0.2 mM each |
25 mM MgSO4 | 3 μL | 1.5 mM |
10 pmol/μL Primer #1 | 0.75–1.5 μL | 0.15–0.3 µM |
10 pmol/μL Primer #2 | 0.75–1.5 μL | 0.15–0.3 µM |
Template DNA | X μL | Genomic DNA ≤ 200 ng/50 μL Plasmid DNA ≤ 50 ng/50 μL cDNA ≤ 200 ng（RNA equiv.)/50 μL |
PCR grade water | Y μL | |
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL) | 1 μL | 1.0 U/50 μL |
总体积 | 50 μL |
**不要使用其它试剂盒或其它公司的dNTP
注意：
最佳引物浓度为0.3 µM。在长片段（≥10kb）的情况下，降低引物浓度（0.15µM）可能会产生更有效的扩增。
二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加有利于扩增富含GC的靶标。在DMSO存在的情况下，PCR保真度不会降低（参见步骤2，循环条件）。
cDNA或基因组DNA中的污染RNA会通过螯合Mg2+来抑制PCR反应。应使用<200 ng RNA的模板DNA进行PCR。
模板DNA的质量应通过电泳检查。模板DNA的长度和纯度会影响扩增结果。
含有尿嘧啶的模板不能用于扩增。
对于PCR反应，建议使用薄壁管。建议总反应体积为50 μL。
2. 循环条件
推荐≥20 mer的引物，Tm>63°C的两步循环条件用于有效扩增。
两步循环：
如果引物的Tm值超过63°C，建议采用两步循环。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的Mg2+浓度（高达2 mM终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。
<25 mer or Tm <68℃: 加2%
≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%
如果扩增失败，可能需要3步循环
三步循环：
当引物的Tm小于63℃时，应使用三步循环。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的Mg2+浓度（高达2 mM终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含GC的片段。
降落PCR：
如果在2步和3步循环条件下观察到非特异性扩增（在PCR产物电泳后观察到额外的条带），降落PCR则可以提高特异性。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的Mg2+浓度（高达2 mM终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。
<25 mer or Tm <68℃: 加2%
≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%
应用实例
性能数据：
1. PCR保真度
用TArget克隆技术对从人基因组DNA中扩增的人β-珠蛋白基因产物进行序列分析，测定突变频率。KOD-Plus-Neo表现出ji好的保真度，突变频率与以前版本的酶（KOD-Plus-）相同。
2. 延伸能力
根据每种酶的推荐条件，通过几种PCR酶从人类基因组DNA中扩增出各种大小的片段。KOD-Plus-Neo成功扩增了17.5 kb的片段。
3. 低拷贝模板扩增
使用0.5 ng cDNA模板扩增四个基因。模板由HeLa细胞的总RNA合成。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有基因。
4. 延伸速度
不同的扩增时间从人类基因组DNA（50ng）中扩增β-珠蛋白基因（3.6 kb）。KOD-Plus-Neo可以用30秒/kb的延长时间扩增3.6 kb的靶标。
应用数据：
1. 各种蛋白激酶片段的扩增
利用HeLa细胞总RNA合成的cDNA扩增各种蛋白激酶开放阅读框。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有片段。
2. 长片段扩增
使用不同浓度的引物从人类基因组DNA中扩增长片段。过多的引物会抑制扩增。因此，应使用约0.15 µM的较低引物浓度扩增长片段（>10 kb）。
常见问题及解决办法
问题 | 可能的原因 | 解决办法 |
无产物或低产量 | 循环条件不合适 | 使用三步循环，将退火温度逐渐降低至最大Tm-5–10°C |
将延伸时间延长至1分钟/kb | ||
将循环次数增加2-5个循环 | ||
Mg2+浓度低 | 将Mg2+浓度增加至2 mM | |
目标序列GC含量高 | 加入2–5%的DMSO | |
引物的质量和/或浓度问题 | 将引物浓度逐步降低至0.15 µM | |
使用新的引物 | ||
重新设计引物 | ||
模板DNA的质量和/或浓度问题 | 检查模板DNA的质量 | |
增加模板DNA的浓度 | ||
酶浓度低 | 将酶浓度提高至1.5–2.0 U/50 μL | |
弥散条带或杂带 | 循环条件不合适 | 将循环次数减少2-5个循环 |
从3步循环更改为2步循环 | ||
从2步循环更改为降落PCR | ||
引物的质量问题 | 使用新的引物 | |
重新设计引物 | ||
模板DNA太多 | 减少模板DNA的浓度 | |
Mg2+浓度太高 | 将MgSO4逐步降低至1.0 mM | |
酶浓度太高 | 将酶浓度降至0.5–0.8 U/50 μL | |
TA克隆效率差 | PCR产物具有平末端 | 使用专用TA克隆试剂盒TArget clone™-Plus-(Code No. TAK-201) |
参考文献
1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).
2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).
3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).
4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).
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货号 | 产品名称 | 规格 | 品牌 |
KOD-401 | KOD -Plus- Neo | 200 reactions | TOYOBO |
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